目的基因甲基化检测

1 高通量 BSP 甲基化测序技术介绍 

重亚硫酸盐处理后测序（bisulfite sequencing PCR, BSP）：是检测基因甲基化的经典方法，其原理为用重亚硫酸盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变，通过设计BSP 引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对 PCR 产物进行测序就可以判断 CpG 位点是否发生甲基化。传统BSP 通过结合克隆及 Sanger 测序，对目的片段甲基化进行测序检测，存在以下几个缺点：1）需要额外的挑选克隆进行Sanger 测序，因此只适合检测位点及样本量很小的情况；2）实验周期长，而且每个片段需要选择至少 20-30 个克隆进行分别测序，单个样本和片段的检查费用很高；3）由于检测克隆有限，因此对于甲基化水平检测的准确性降低。因此，传统BSP 结合克隆测序的方法不能满足多为点（几个到几十个基因）及大样本（几十到几百个）的甲基化检测需求。由于高通量测序技术发展，我们首次把 BSP 和高通量测序技术结合，开发了 NGS-BSP 方法，并通过与传统 BSP 克隆测序进行比较，证实了 NGS-BSP 方法具有更高的准确性，目前，由于通量及成本的优势，NGS-BSP 方法越来越多的应用于以下 

2 方面课题的研究：

a） 甲基化测序验证：对 WGBS、RRBS、靶向区域甲基化测序等技术方法找到的差异甲基化基因，通过NGS-BSP 进行验证; 

b） 寻找甲基化分子标记物：通过对几个到几十个感兴趣的目标基因（通常是某些信号通路基因或者与疾病相关的基因）的启动子进行大样本量（几十个到上百个）检测甲基化水平，通过和样本临床特征进行统计分析，寻找疾病发生的分子标记物或者用于疾病的诊断、分类、治疗及预后评估等目的的研究。由于 NGS-BSP 方法在大样本检测甲基化具有绝对的准确性、快速的实验周期及价格优势，目前在医院特别是肿瘤研究方向具有很好的应用价值。 

3 技术参数 

(1) 测序平台：PE150 

(2) 测序量：不低于 200X 

(3) 项目周期：30 个工作日 (BSP 引物设计验证合格及样本检查合格后算起)

4分析内容 

基础分析 1 

1. 测序数据质量评估：有效数据量、碱基质量值等评估； 

2. 数据处理及比对：去接头污染, 去低质量reads; 

3. 与扩增子序列比对； 

基础分析 2 

4. 计算 CG 碱基的甲基化水平 

5. 统计 CG 碱基的甲基化水平的差异显著性 

5.1 基因区域上位点在组间样本的甲基化水平的可视化 

5.2 基因的平均甲基化水平在组件样本间的分布 

5.3 基于甲基化水平的样本聚类分析 

个性化分析 

6. 与临床样本特征关联分析 

6.1 样本甲基化水平与表达数据的关联分析 

6.2 样本甲基化水平与特定临床特征的关联分析