RNA甲基化测序

表观转录组指 RNA 序列不发生改变的情况下，由 RNA 上的化学修饰调节基因表达的现象。胞内RNA 的修饰超过 100 种，其中大部分的表观修饰发生在 tRNA 及其他非编码 RNA 上[1]，发生在 mRNA上的修饰无论是从种类上还是数量上都较少。下图展示了部分发生在真核生物 mRNA 上的化学修饰[2]：

mRNA 上含量最高的修饰是腺苷酸 N6 位的甲基化修饰(N6-methyladenosine，m6A)，m6A 参与mRNA 生命周期的各个方面[2]。m6A 修饰主要发生在 RRACH (R = G or A and H = A,C, or U)这类 motif上，这类 motif 主要在终止密码子和 3’UTR 处富集，即 m6A 主要发生在终止密码子和3’UTR 附近。m6A 修饰由 m6A 甲基转移酶（writers）催化产生，被 m6A 去甲基酶（erasers）去除，被m6A 结合蛋白（readers）识别并发挥功能[3]。m6A 修饰广泛存在于各类生物中，包括病毒、从酵母、植物和 人类等高等动物[1,3]。研究表明，m6A 已知的最主要功能是调控 mRNA 的稳定性：胞质内经过 m6A 修饰的 mRNA 可以被 YTHDF2 识别，使其富集到 Processing body（P-body）从而加速 mRNA 的降解。此外，m6A 修饰还可以改变 RNA 的二级结构、调控 microRNA 的靶标识别来调控 mRNA 的稳定性。在核内，m6A 修饰可以调控 RNA 的剪接、出核过程，从而调控基因表达。m6A 还可能与 DNA 甲基化存在互作关系。下图展示了部分目前已知的 m6A 与生物功能的关系：

早期的实验方法已经在 rRNA 和 mRNA 中鉴定到 m6A 的存在，但由于实验技术的限制，对 m6A 的研究一直没有大的进展。近年来，RNA 去甲基化酶 FTO 的报道，使得对 m6A 修饰的研究再次进入人们的视野。随后，MeRIP-seq/m6A-seq 实验方法的建立使得我们有机会对该修饰的分布和功能进行深入研究[1]。本产品利用 MeRIP-Seq/m6A-Seq 技术鉴定全基因组范围内具有 m6A 修饰的区域。其原理为通过特异识别 m6A 修饰的抗体，对细胞内具有 m6A 修饰的 RNA 片段进行免疫共沉淀。对沉淀下来的 RNA片段进行高通量测序，结合生物信息学分析，即可在全基因组范围内对 m6A 修饰的状况进行系统研究。MeRIP-Seq/m6A-Seq 是目前研究 m6A 修饰使用最广泛的技术之一。 

实验流程：

从样品处理到最终数据获得中每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果。为了从源头上保证测序数据的准确性、可靠性，我们对样品处理、建库、测序每一个生成步骤都严格把控，从根本上保证了高质量数据的产出。流程图如下：

信息分析流程：

分析结果展示： 

3.1 质控及及评估

3.1.1 数据质控 

3.1.2 比对统计

3.1.3 插入片段长度统计

3.1.4 全基因组覆盖度统计

3.1.5 测序饱和度分析

3.2 m6A 富集区域（peak）的鉴定及统计

3.2.1 m6A 富集区域（peak）的鉴定与注释

3.2.2 m6A 富集区域的基本统计

3.2.3 m6A 富集区域在染色体上的分布

3.2.4 m6A 富集区域在基因元件上的分布

3.2.5 m6A 富集区域关联基因的功能富集分析

3.2.6 m6A 富集区域在基因元件上的分布密度

3.2.7 m6A 修饰区域的 motif 鉴定

3.2.8 特定基因峰图展示

3.3 差异 m6A 修饰的鉴定及统计

3.3.1 组内样本 peak 重叠情况分析

3.3.2 组内样本 peak 关联基因的重叠情况分析

3.3.3 差异 m6A 修饰的鉴定与注释

3.3.4 差异 m6A 修饰的基本统计

3.3.5 差异 m6A 修饰在染色体上的分布

3.3.6 差异 m6A 修饰在基因元件上的分布

3.3.7 差异 m6A 修饰关联基因的富集分析

3.3.8 差异 m6A 修饰在基因元件上的分布密度

3.3.9 差异 m6A 修饰区域的 motif 鉴定

3.4 表达水平分析及差异表达基因鉴定

3.4.1 基因表达水平分析

3.4.2 基因表达水平密度分析

3.4.3 基于表达谱的聚类分析

3.4.4 基于表达谱的主成分分析

3.4.5 基于表达谱的相关性分析

3.5 差异表达基因鉴定及富集分析

3.5.1 差异表达基因鉴定

3.5.2 差异基因功能富集分析

3.6 差异 m6A 修饰及差异基因关联分析