外泌体三项鉴定

1、外泌体简介

外泌体（Exosomes）产生于细胞中的多泡体，是活细胞分泌的直径约为30~150 nm 的膜性囊泡，密度为 1.13-1.19 g/ml，有典型的“杯盘”形态。人体中 几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，近乎于平均每个人体细胞产生 1000- 10000 个。通常 1ml 血液中存在 1×10^12 个外泌体。外泌体具有异质性，即使 是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别。外泌体几乎存在于所 有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体携带了 参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA 以及其降解 片段，参与细胞活动的重要调控；在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发 展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾 病的早期诊断标志物。

2、实验试剂和仪器

3、实验方法

3.1 超速离心法提取外泌体

1 在37 ℃中速融样本。

2 将样本移动至一个新的离心管内，2000 × g，4 ℃，30 min离心。

3 小心的将上清液移至新的离心管中，10,000 × g，4 ℃，45 min再次离心，以去除较大的囊泡。

4 取上清，经0.45 μm滤膜过滤，收集过滤液。

5 将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4 ℃，100,000 × g 离心70 min。

6 去除上清，用10 mL预冷的1×PBS重悬后，选择超速转子，再次4 ℃，100,000 ×g，超速离心70 min。

7 去除上清，用200 μL预冷的1×PBS重悬，取20 μL电镜，10 μL粒径，10 μL提蛋白，30 μL荧光，剩余外泌体于-80℃保存。

3.2 外泌体样品透射电镜观察

1 将外泌体取出10 μL。

2 吸取样品10 μL滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液。

3 醋酸双氧铀10 μL滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液。

4 常温干燥数分钟。

5 100 kv进行电镜检测成像。

6 获得透射电镜成像结果。

3.3 外泌体样品粒径分析

1 将外泌体取出10 μL稀释到30 μL。

2 先用标准品进行仪器性能测试合格后方可进行外泌体样品上样，注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针。

3 待样本完成检测即可获得仪器检测外泌体的粒径和浓度信息。

3.4 外泌体样品蛋白提取及浓度测定

1 在37 ℃中速融外泌体，并迅速加入5 × 的RIPA裂解液。

2 混匀后在冰上裂解30 min，期间混匀。

3 配制BCA法测蛋白浓度的标准样品，并取5 μL样品加入到BCA混合液中，混匀。

4 37 ℃孵育30 min，酶标仪上在OD562 nm处检测吸光值并记录。

5 根据标准曲线算出待测样品蛋白浓度。

3.5 外泌体样品荧光标记及纳米流式检测

1 将30 μL外泌体稀释至90 μL，取30 μL稀释外泌体分别加入20 μL荧光标记的抗体（CD9、CD81、IgG），混匀，避光37℃孵育30min。

2 加入1 mL预冷的PBS，选择超速转子，4 ℃，110,000 × g，超速离心70 min。

3 小心去除上清，加入1 mL预冷的PBS，选择超速转子，再次4 ℃，110,000 × g，超速离心70 min。

4 小心去除上清，用50 μL 预冷的1×PBS重悬。

5 先用标准品进行仪器性能测试合格后方可进行外泌体样品上样，注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针。

6 待样本完成检测即可获得仪器检测蛋白指标结果。

样本要求

样品类型：

细胞、体液或RNA样品。其它类型样品请详询。

样品量：

①体液 全血、血清、血浆 ：5 mL  

②脑脊液：8 mL  

③尿液：100 mL

④细胞上清：50ml

⑤外泌体：100ul

保存和运输条件：

负八十长期保存，干冰运输。提取的外泌体在短时间（一周之内）使用，可以放在4度保存，如果长时间保存可以放在-80度保存。